安捷倫二維液相色譜助力維生素 D 測定第四法
安捷倫二維液相色譜精準助力應對 2020 版藥典 0722 維生素 D 測定第四法
維生素 D 是人體所必須的脂溶性維生素。維生素D的基本作用是能促進鈣和磷的吸收，缺乏維生素 D，會影響鈣的吸收和骨代謝，最終引起佝僂病、軟骨癥或骨質(zhì)疏松癥等。作為藥物的維生素 D 相關制劑是補充維生素 D 缺乏的最直接的途徑。準確測定維生素 D 及其前體的含量，能夠保證維生素 D 達到目標的效價，從而保證藥物的有效性和安全性。
安捷倫二維液相色譜精準助力應對
2020 版藥典 0722
維生素 D 測定第四法
2020 版藥典 0722 新增維生素 D 測定第四法相關背景
維生素 D 測定的難點在于含維生素 A 醇及其他相應脂溶性雜質(zhì)的供試品，如維生素 AD 軟膠囊、滴劑等，其基質(zhì)中存在大量油性輔料（大豆油）和維生素 A 醇的干擾，同時維生素 D2/D3 含量低（部分品種維生素 D2/D3 含量僅占 1‰ 左右) ，加上維生素 D 易受光熱影響產(chǎn)生前維生素 D（pre-vitamin D）、反式維生素 D (Trans vitamin D)、速甾醇（tachysterol）和光甾醇（lumisterol）等。對于本類樣品，2015 版藥典和 2020 版藥典的第二法和第三法，通常需要將樣品進行皂化、有機溶劑液液萃取，結合反相色譜系統(tǒng)凈化，最后再采用正相色譜系統(tǒng)進行定量檢測。方法測定結果的準確性和重現(xiàn)性較難控制，也嚴重影響方法的分析效率。
通過二維柱切換的液相色譜技術不僅可以提升系統(tǒng)分離能力，改善結構相似化合物的分離分析；同時可以通過第一維的初步分離去除樣品基質(zhì)中大量雜質(zhì)成分干擾，實現(xiàn)樣品凈化。因此 2020 版藥典 0722 維生素 D 測定新增了第四法即在線二維液相色譜法，方法第一維和第二維均采用正相色譜體系，其主要優(yōu)點是樣品可用正己烷溶解后直接進樣分析，且具有載樣量大，易去除非極性基質(zhì)干擾成分，同時維生素 D 與其他羥基化的代謝物分離良好等優(yōu)點。
安捷倫的應對方案
儀器系統(tǒng)的基本搭配如圖 1 所示，整體上需要兩套泵、一個兩位六通切換閥、單或雙紫外檢測器組成。
主要色譜條件
色譜柱：
第一維：ChromCore VD-ChP4, 2.1*150mm，3μm（納譜分析，貨號S015-030012-02115S）；
第二維：Zorbax Silica, 3.0*100mm, 1.8μm（Agilent Technologies，貨號 828975-301）；
流動相：第一維：A: 正己烷；B: 異丙醇; C: 正己烷：正戊醇：異丙醇 (98：1：1); 按下表進行梯度洗脫：
表 1. 第一維流動相梯度
第二維：正己烷：正戊醇：異丙醇=996：2：2；等度洗脫。
流速：0.5 mL/min;
柱溫：40℃；
波長：265 nm；
閥切時間窗口：前維生素 D， 保留時間前后各 1.5min；維生素 D，出峰開始前和結束后各 1.5 min；Loop 環(huán)體積為 9 mL。
對照品和樣品溶液按照《中國藥典》2020 年版四部通則 0722 維生素 D 測定法第四法要求進行制備。
主要結果
1、對照品分析譜圖
按照藥典采用脲基修飾的 HILIC 色譜柱和正相體系作為第一維分離，結果前維生素 D 和維生素 D 的分離度為 9.8，維生素 D 的理論板數(shù)為 7600，*系統(tǒng)適應性測試要求；目標物在第二維分離的峰對稱性良好。
2、實際樣品與對照品疊加譜圖
由第一維的樣品分離譜圖可以看出，雖然維生素 D 分離良好，但前維生素 D 由于含量較低，易受到前面大量基質(zhì)的干擾，通過柱切換方式將該目標組分切至第二維進行分離，能夠對前維生素 D 實現(xiàn)無干擾分離分析。
小結
通過二維柱切換法，能夠有效去除樣品基質(zhì)干擾，改善前維生素 D 的分離，實現(xiàn)對前維生素 D 和維生素 D 的定量分析；
本法對原有標準方法中 35~60min 的清洗過程進行適當調(diào)整，嵌入了強洗過程，既利于強保留化合物的快速洗脫（圖 3 中 36-46min 色譜峰），縮減整體分析時間（由 80min 縮減到 65min），加快分析效率，也可避免潛在的強保留物質(zhì)對后續(xù)分析造成影響，使第一維分離更穩(wěn)定；
由于流動相配制和色譜柱批次間的差異，需要適當調(diào)整維生素 D 在第一維色譜柱上的出峰時間在 25min 左右，同時通過對流動相比例的微調(diào)，可以使樣品中含量較低且易受基質(zhì)干擾的前維生素 D 在第二維中分離更好。
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